Maria Magdalena von Österreich stammte aus dem habsburgischen Haus Innerösterreich als jüngste Tochter des Erzherzogs von Innerösterreich und einer Wittelsbacher Herzogstochter; ihre Herkunft wies auf die engen dynastischen Verbindungen zwischen den führenden Fürstenhäusern des Heiligen Römischen Reiches hin.

Im Rahmen dynastischer Heiratsstrategien des frühen 17. Jahrhunderts wurde sie mit einem Großherzog von Toskana aus dem florentinischen Herrscherhaus Medici vermählt. Diese Ehe verband die habsburgische und die toskanische Fürstenlinie, diente politischen Allianzen und etablierte enge familiäre Verknüpfungen zwischen den kaiserlichen und italienischen Fürstendynastien.

Während ihrer Zeit in Florenz wirkte sie nicht nur repräsentativ, sondern übernahm nach dem frühen Tod ihres Gemahls gemeinsam mit ihrer Schwiegermutter die Regentschaft für ihren minderjährigen Sohn, der die Regierung des Großherzogtums fortführte. Unter ihrer Mitverantwortung prägten konfessionelle Ausrichtung und höfische Kultur die politischen Rahmenbedingungen und den Umgang mit religiösen Gelehrten jener Epoche.
Aus dieser Ehe gingen mehrere Kinder hervor, darunter ein Sohn, der später als Großherzog wirkte, sowie weitere Söhne und Töchter, die durch kirchliche oder eheliche Verknüpfungen in andere Fürstenhäuser eingebunden wurden. Diese Nachkommenschaft trug zur Verstetigung des habsburgisch-mediceischen Netzwerks bei und reflektierte die Bedeutung ehelicher Allianzen für dynastische Kontinuität und territoriale Sicherung.
Maria Magdalena kehrte auf Einladung ihres kaiserlichen Bruders nach Mitteleuropa zurück und verstarb unterwegs auf einer Reise, was ihren Lebensweg zwischen den politischen Räumen des Reiches und Italiens markierte.